TECHNICAL RESOURCES

PerkinElmerMultiplate reader를 활용한 DNA/Protein 정량

2019-03-13 08:01






    

    VICTOR Nivo multimode plate reader

        - 활용도 높은 벤치탑 형태의 플레이트 리더

        - 다양한 형광 측정이 가능한 필터구

        - 흡광에 한하여 spectrometer 선택 가능

        - DNA 및 단백질의 정량과 purity 계산

        - 96-well, 384-well plate 사용으로 다량의 DNA/단백질을 동일한 condition으로 빠르고 쉽게 정량






방법 1. 흡광으로 DNA 정량하기


   1) UV plate 준비: 추천하는 UV plate (Greiner Bio-One UV-Star Microplate #655801, #781801)

   2) 260 nm에서 DNA와 280 nm에서 단백질을 측정

        Sample lading 양: 200 ul (96-well plate)

                                        50 ul (384-well plate)

        * Dilution 하거나 stock 상태로 사용

   3) DNA 정량 공식을 바탕으로 VICTOR Nivo에서 결과값 산출 

  

        









Figure 1. Inter-plate variation of OD260 measured using the DNA sodium salt standard from calf thymus. Data points represent mean of four plate replicates ± SD. Right represents a magnified region of detected signal for low DNA concentrations. Data show good linear correlation with low SD. Saturation of the OD260 was observed for ≥ 100 μg/mL DNA.



방법 2. Quanti-iT Picogreen (형광)으로 DNA 정량하기

   1) Picogreen 시약과 DNA를 1:1로 섞기

   2) Black, non-binding 384-well microplate로 transfer

   3) VICTOR Nivo 안에서 측정 전 약 10분 incubation

   4) ex 485 nm, em 535 nm에서 측정

 특징: Quanti-iT Picogreen을 이용하면 낮은 농도의 DNA 측정에 유리

          dsDNA만을 선택적으로 정량

          UV흡광 결과보다 민감도 우수

         0.5 ng/ml ~ 1,000 ng/ml 까지 정비례

Figure 2. Fluorescence signal measured for the DNA sodium salt standard from calf thymus using the Quant-iT™ PicoGreen® assay. 

Left: Linear fit of the DNA standard dilution series in 384-well and 96-well formats. Right: Graph represents magnified region of detected signal for low DNA concentrations. Data points represent mean of four replicates ± SD. 


방법 3. Bradford 염색 (흡광)으로 단백질 정량하기

   1) 단백질과 Bradford 용액을 1:50으로 희석

   2) Clear plate로 시료를 옮긴 후 10분간 incubation

   3) Spectrometer 옵션을 이용하여 ex 595 nm에서 측정

   4) 50 μg/ml protein (BSA), O.D 1까지는 농도에 비례







Figure 3. Detected OD595 of the BSA standard. A: Linear fit of the BSA standard dilution series in 384-well and 96-well formats. Values represent the mean of four replicates ± SD. B: Inter-plate variation of OD595 measured using the BSA standard. Data points represent mean of four plate replicates ± SD. C: Graph represents a magnified view of detected signal for low BSA concentrations.Linear correlation was observed in the tested range 1 – 55 μg/mL protein.


방법 4. Qubit Protein Assay Kit (형광)으로 단백질 정량하기

   1) Qubit working solution에 BSA standard를 1:20으로 dilution

   2) 상온에서 15분간 incubation 후 black, non-binding 384-well microplate로 transfer

   3) ex 485 nm, em 615 nm으로 형광 측정

   4) BSA 0.6 μg/ml ~ 10 μg/ml 까지 농도 정비례

















Figure 4. Fluorescence signal measured for the BSA standard from calf thymus using the Qubit® Protein Assay Kit. A: Fit of the BSA standard dilution series in 384-well and 96-well formats. Values represent the mean of four replicates ± SD. B: Graph represents a magnified region of detected signal for low DNA concentrations. Values represent the mean of four replicates ± SD. C: Inter-plate variation of OD595 measured using the BSA standard. Data points represent the mean of four plate replicates ± SD. D: Graph represents a magnified region of detected signal for low BSA concentrations. Linear correlation was observed in the tested range 0.3 – 10 μg/mL protein.


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T. 1833-8575 / E. technical@dawinbiotech.com



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