Two-step Activation of Inflammasome
Inflammasome은 Priming과 Activation이라는 Two-step Activation model을 사용합니다.
첫째, Priming step은 Inflammasome assembly 및 Downstream signaling에 필요한 단백질의 Transcriptional upregulation을 허용합니다. 일단 Priming되면 센서는 자동으로 억제되지만 Signal-sensitive 상태로 유지됩니다. 이들은 서로 다른 PAMP와 DAMP에 의해 활성화됩니다.
Inflammasome Activation은 Priming된 센서의 Post-translational modification을 유도하여 구조적 변화가 억제되지 않게 합니다. Activation 및 Assembly 전략은 Inflammasome마다 다릅니다. 각 Inflammasome에는 고유한 센서 Activation 및 플랫폼 Assembly가 있습니다.
- Canonical NLRP3 Inflammasome - Hot Spot
NLRP3는 현재 가장 많이 연구된 센서이고, NLRP3 Inflammasome은 전형적이고 가장 잘 특징지어지는 Inflammasome입니다. NLRP3는 구조적, 화학적 특성이 다양한 광범위한 자극에 의해 활성화될 수 있으며, 일반적으로 멸균, 미생물 또는 환경적일 수 있습니다.
그러나 NLRP3 Activation의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 여전히 논란의 여지가 있는 주제이지만, NLRP3 Inflammasome에 대한 Priming 메커니즘 차이는 설명되었습니다. 예를 들어, 장기적인 TLR stimulation (>3h)은 새로운 NLRP3 모듈의 NF-κB mediated transcription를 유발하는 반면, 더 짧은 TLR 자극(<1h)은 Basal level에 존재하는 NLRP3 단백질의 Post-translation modification을 유발할 가능성이 더 높습니다
- Canonical NLRP1 Inflammasome - Interspecies Difference
NLRP1이 Inflammasome 센서로 처음 기술되었지만 면역에서의 역할과 기능에 대한 이해는 오랫동안 과소평가되어 왔습니다. 제한 사항 중 하나는 다른 종, 특히 인간과 설치류 사이의 보존이 좋지 않다는 것입니다.
예를 들어, 바이러스 복제의 전형적인 특징인 long dsRNA는 그 자체로 인간 NLRP1을 활성화시키기에 충분합니. 그러나 영장류와 설치류 사이의 NLRP1의 보존은 낮고, Sensing mode는 인간과 쥐 시스템 사이에 공유되지 않습니다.
따라서 동물 모델, 특히 쥐 모델을 기반으로 한 결과는 인간 구조와 완벽하게 평행하지 않기 때문에 대체 인간 모델이 더 바람직하다는 것을 나타냅니다. InvivoGen은 이 과정을 용이하게 하기 위해 일종의 Human derived reporter cell line을 제공합니다.
NLRP1 Inflammasome Activation Protocol |
Model | Priming | Activation | PMID |
Murine BMDMs
| 100ng/ml LPS-B5 for 3h
| 20ng/ml poly(I:C) transfected for 8h
| 37360982
|
Murine BMDMs
| 100ng/ml LPS-B5 for 3h
| 100μg/ml L18-MDP transfected for 16h
| 37360982
|
Murine BMDMs
| 500ng/ml LPS-EB for 3h
| 1μg/ml Bacillus anthracis LA for 3-6h
| 33017103
|
Murine BMDMs
| 1μg/ml Pam3CSK4 for 2h
| 20μg/ml PA and 10μg/ml LA for 2.5h
| 30872533
|
Murine BMDMs
| 100ng/ml LPS-B5 for 3h
| 2.5μM Talabostat for 24h
| 37360982
|
Murine BMDMs
| 1μg/ml LPS-EB Ultrapure* for 1h
| 10μM/ml Talabostat for 18h
| 33017103
|
Primary HCEC
| 15μM Talabostat for 24h
| 37642996
|
Primary HNEC
| 15μM Talabostat for 24h
| 37642996
|
| A549-ASC Cells | 10^5 bacteria of P. aeruginosa for 24h | 37642996 |
| A549-ASC-NLRP1 Cells | Following manufacturer’s protocols | 37642997 |
| A549-ASC-NLRP1 Cells | 10^5 bacteria of P. aeruginosa for 24h | 37642996 |
AIM2는 Microbial 혹은 Host의 Cytosolic double-strand DNA에 대한 수용체로 서열 독립적이지만 길이 의존적입니다. 70bp 이상의 dsDNA 길이는 AIM2 Inflammasome의 활성화에 필요한 것으로 보고된 반면, 200bp의 dsDNA는 최적의 활성화를 유발합니다.
- Canonical NLRC4/NAIP Inflammasome
NLRC4는 Ligands에 대한 NAIP 결합과 관련된 Bacteria type III 또는 IV 분비 시스템에서 Flagellin, 또는 Inner Rod 및 Needle proteins과 같은 세포 내 박테리아 분자를 감지합니다.
- Non-canonical CASP-11 & CASP-4/5 Inflammasome
마우스의 CASP-11과 인간의 CASP-4 및 CASP-5는 센서 및 effectors molecules 역할을 하며 Non-canonical inflammasomes을 형성합니다. 둘 다 Cytosolic LPS를 직접 감지하고 Non-canonical inflammasomes을 유도하여 CASP-1-dependent IL 1β, IL-18 분비, CASP-1-independent cell death를 초래합니다.
CASP11의 활성화는 세포질의 LPS에 의존합니다. LPS의 세포질 국소화는 OMV에 의해 매개되며, OMV는 Endocytosis을 통해 내재화된 후 초기 Endosomes에서 세포질로 LPS를 방출합니다. InvivoGen은 in vitro 연구에 권장되는 E. coli OMVs를 포함하여 CASP11 및 CASP-4/5 Inflammasome의 Inducer로 OMV를 제공하고 in vivo 연구에는 E. coli OMV InvivoFit™를 제공합니다.
그러나 human CASP-4/5 및 mouse CASP-11의 Basal expression은 세포 유형에 따라 다르며, 인간에게 두 개의 CASP-11 Counterparts가 존재한다는 것은 인간과 마우스의 종간 차이에 대한 의문을 제기합니다. CASP-4/5의 정확한 기여를 위해서는 추가 연구를 위해 인간 특정 플랫폼이 필요합니다.
GSDMD는 Canonical과 Non-canonical의 Key downstream effector입니다. GSDMD는 CASP-1, CASP-4, CASP-5 및 CASP-11에 의해 분해되어 지질막에 Pore을 형성하여 Mature IL-1β 및 IL-18을 분비할 수 있으며 궁극적으로 Pyroptotic cell death로 이어집니다.
세포독성 때문에 GSDMD에 대한 연구는 유도 가능하고 고도로 제어되는 발현 시스템을 필요로 합니다. InvivoGen은 GOI leakiness을 최소화하기 위해 강력하고 안정적으로 TetR 발현하는 Tiger Tet-on System을 제공합니다. GOI에 의해 세포독성 단백질이 발현될 때, 최소화된 Leakiness은 세포가 가능한 세포독성으로부터 생존할 수 있도록 하여 GSDMD 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Invivogen Cytotoxic Protein Expressing Cells |
Cell Lines | Application |
THP1-KO-GSDMD Cells
| Monitoring GSDMD-dependent inflammasome repones
|
RAW-ASC KO-GSDMD Cells
| Monitoring GSDMD-dependent ASC activities
|
A549-RepTor™ Cells
| Controlled expression of cytotoxic genes (e.g., GSDMD) in A549 cells
|
HEK-RepTor™ Cells
| Controlled expression of cytotoxic genes (e.g., GSDMD) in HEK293 cells |
Inflammasome Activation Assay
Inflammasome activation은 ASC speck formation, Pyroptotic cell death 유도 및 생체 활성 IL-1β/18 사이토카인 분비와 같은 Signature event로 이어집니다. InvivoGen은 Inflammasome activation을 연구하기 위한 간단하고 신속하며 신뢰할 수 있는 검출 및 Qualification 플랫폼을 제공하는 Reporter cell line을 개발했습니다.
빨간색으로 표시된 모든 세포와 시약은 InvivoGen에서 제공합니다.
*표시된 제품은 InvivoFit™ 및 Ultrafure 등급으로 InvivoGen에서 독점 제공합니다.
[학술문의] T. 031-728-3236 E. technical@dawinbio.com
#invivogen #다윈바이오 #inflammasome #NLRP
Two-step Activation of Inflammasome
Inflammasome은 Priming과 Activation이라는 Two-step Activation model을 사용합니다.
첫째, Priming step은 Inflammasome assembly 및 Downstream signaling에 필요한 단백질의 Transcriptional upregulation을 허용합니다. 일단 Priming되면 센서는 자동으로 억제되지만 Signal-sensitive 상태로 유지됩니다. 이들은 서로 다른 PAMP와 DAMP에 의해 활성화됩니다.
Inflammasome Activation은 Priming된 센서의 Post-translational modification을 유도하여 구조적 변화가 억제되지 않게 합니다. Activation 및 Assembly 전략은 Inflammasome마다 다릅니다. 각 Inflammasome에는 고유한 센서 Activation 및 플랫폼 Assembly가 있습니다.
NLRP3는 현재 가장 많이 연구된 센서이고, NLRP3 Inflammasome은 전형적이고 가장 잘 특징지어지는 Inflammasome입니다. NLRP3는 구조적, 화학적 특성이 다양한 광범위한 자극에 의해 활성화될 수 있으며, 일반적으로 멸균, 미생물 또는 환경적일 수 있습니다.
그러나 NLRP3 Activation의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 여전히 논란의 여지가 있는 주제이지만, NLRP3 Inflammasome에 대한 Priming 메커니즘 차이는 설명되었습니다. 예를 들어, 장기적인 TLR stimulation (>3h)은 새로운 NLRP3 모듈의 NF-κB mediated transcription를 유발하는 반면, 더 짧은 TLR 자극(<1h)은 Basal level에 존재하는 NLRP3 단백질의 Post-translation modification을 유발할 가능성이 더 높습니다
250mg/ml Nano-SiO2 for 6h
or 2μg/ml poly(dA:dT) transfected for 6h
500ng/ml LPS-EB Ultrapure* for 3h
or 1μg/ml Pam3CSK4 for 3h
or 10^7 cells/ml HKLM for 3h
or 1μg/ml FLA-ST for 3h
or 1 μg/ml FSL-1 for 3h
or 1 μg/ml ssRNA40 for 3h
or 200ng/ml ODN 1826 for 3h
5mM ATP for 30min
or 40μM nigericin for 45min
or 100μg/ml MSU for 6h
THP-1 NLRP3-deficient cells*
THP-1 NLRP3-deficient cells*
Intraperitoneal injection with 1mg/kg LPS-EB Ultrapure* in PBS
Intraperitoneal injection with 2mg MSU in 200μl PBS
Intranasal administrated with 50μl 10^7 TU/ml E-protein lentiviruses
Intranasal administrated with 50μg poly(I:C) for 24h
Intraperitoneal injection with 2mg MSU in 200μl PBS
Intraperitoneal injection with 20μl 10mg/ml MSU for 4h
NLRP1이 Inflammasome 센서로 처음 기술되었지만 면역에서의 역할과 기능에 대한 이해는 오랫동안 과소평가되어 왔습니다. 제한 사항 중 하나는 다른 종, 특히 인간과 설치류 사이의 보존이 좋지 않다는 것입니다.
예를 들어, 바이러스 복제의 전형적인 특징인 long dsRNA는 그 자체로 인간 NLRP1을 활성화시키기에 충분합니. 그러나 영장류와 설치류 사이의 NLRP1의 보존은 낮고, Sensing mode는 인간과 쥐 시스템 사이에 공유되지 않습니다.
따라서 동물 모델, 특히 쥐 모델을 기반으로 한 결과는 인간 구조와 완벽하게 평행하지 않기 때문에 대체 인간 모델이 더 바람직하다는 것을 나타냅니다. InvivoGen은 이 과정을 용이하게 하기 위해 일종의 Human derived reporter cell line을 제공합니다.
AIM2는 Microbial 혹은 Host의 Cytosolic double-strand DNA에 대한 수용체로 서열 독립적이지만 길이 의존적입니다. 70bp 이상의 dsDNA 길이는 AIM2 Inflammasome의 활성화에 필요한 것으로 보고된 반면, 200bp의 dsDNA는 최적의 활성화를 유발합니다.
1μg/ml poly(dA:dT)transfected for 4h
or 100ng/ml LFn-Needle and PA for 4h
NLRC4는 Ligands에 대한 NAIP 결합과 관련된 Bacteria type III 또는 IV 분비 시스템에서 Flagellin, 또는 Inner Rod 및 Needle proteins과 같은 세포 내 박테리아 분자를 감지합니다.
200μg/ml MSU for 1-6h
or 2μg/ml poly (dA:dT)/Lyovec for 1-6h
or 10ng/ml LFn-Rod for 1-6h
1μg/ml poly(dA:dT) transfected for 4h
or 100ng/ml LFn-Needle and PA for 4h
Human epithelial cells
2μg/ml flagellin Ultrapure* for 2-8h
or 150μg/ml LFn-Needle for 2h
마우스의 CASP-11과 인간의 CASP-4 및 CASP-5는 센서 및 effectors molecules 역할을 하며 Non-canonical inflammasomes을 형성합니다. 둘 다 Cytosolic LPS를 직접 감지하고 Non-canonical inflammasomes을 유도하여 CASP-1-dependent IL 1β, IL-18 분비, CASP-1-independent cell death를 초래합니다.
CASP11의 활성화는 세포질의 LPS에 의존합니다. LPS의 세포질 국소화는 OMV에 의해 매개되며, OMV는 Endocytosis을 통해 내재화된 후 초기 Endosomes에서 세포질로 LPS를 방출합니다. InvivoGen은 in vitro 연구에 권장되는 E. coli OMVs를 포함하여 CASP11 및 CASP-4/5 Inflammasome의 Inducer로 OMV를 제공하고 in vivo 연구에는 E. coli OMV InvivoFit™를 제공합니다.
그러나 human CASP-4/5 및 mouse CASP-11의 Basal expression은 세포 유형에 따라 다르며, 인간에게 두 개의 CASP-11 Counterparts가 존재한다는 것은 인간과 마우스의 종간 차이에 대한 의문을 제기합니다. CASP-4/5의 정확한 기여를 위해서는 추가 연구를 위해 인간 특정 플랫폼이 필요합니다.
GSDMD는 Canonical과 Non-canonical의 Key downstream effector입니다. GSDMD는 CASP-1, CASP-4, CASP-5 및 CASP-11에 의해 분해되어 지질막에 Pore을 형성하여 Mature IL-1β 및 IL-18을 분비할 수 있으며 궁극적으로 Pyroptotic cell death로 이어집니다.
세포독성 때문에 GSDMD에 대한 연구는 유도 가능하고 고도로 제어되는 발현 시스템을 필요로 합니다. InvivoGen은 GOI leakiness을 최소화하기 위해 강력하고 안정적으로 TetR 발현하는 Tiger Tet-on System을 제공합니다. GOI에 의해 세포독성 단백질이 발현될 때, 최소화된 Leakiness은 세포가 가능한 세포독성으로부터 생존할 수 있도록 하여 GSDMD 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Inflammasome Activation Assay
Inflammasome activation은 ASC speck formation, Pyroptotic cell death 유도 및 생체 활성 IL-1β/18 사이토카인 분비와 같은 Signature event로 이어집니다. InvivoGen은 Inflammasome activation을 연구하기 위한 간단하고 신속하며 신뢰할 수 있는 검출 및 Qualification 플랫폼을 제공하는 Reporter cell line을 개발했습니다.
빨간색으로 표시된 모든 세포와 시약은 InvivoGen에서 제공합니다.
*표시된 제품은 InvivoFit™ 및 Ultrafure 등급으로 InvivoGen에서 독점 제공합니다.
[학술문의] T. 031-728-3236 E. technical@dawinbio.com
#invivogen #다윈바이오 #inflammasome #NLRP