Western blot단백질 정량 (Protein Quantification)

[GenDEPOT] 

단백질 정량 (Protein Quantification)

SDS-PAGE gel 전기영동과 같은 단백질 관련 연구를 하는데 있어서 단백질 정량은 매우 중요한 단계입니다. 단백질 관련 실험에서는 sample간 특정 단백질 양의 차이를 확인하기 때문에 각 sample의 단백질 총량을 맞추는 과정이 필요합니다.

단백질 정량은 여러가지 방법이 있으며, 흔히 실험실에서 Bradford method와 BCA method가 사용되고 있습니다.


1. Bradford method

: Coomassie Brilliant Blue G-250의 단백질 내 특정 아미노산 잔기의 결합력을 이용하여 정량하는 방법

Coomassie Brilliant Blue G-250(GBBG)가 [Arg, Lys-Electrostatic attraction], [Trp,Tyr, Phe, His-Hydrophobic interaction]에 결합합니다. 이 반응의 결과로 적갈색 form(465nm)이였던 dye는 파란색 form(610nm)으로 변하게 됩니다. 두 가지 form의 흡광도의 차이는 595nm에서 최대가 되는데, 이 파장이 coomassie dye-protein complex의 blue form을 측정하는데 최적의 파장대입니다. 보이는 색깔 변화로 흡광도의 변화를 측정하며, 소요시간이 짧고 간단한 반면, coomassie dye가 salt, detergent, lipid 등에 의해 정량값에 영향을 받는 단점이 있습니다.


Protocol  information

      A. Albumin(BSA) standard 희석 준비

           아래 표를 참고하여 protein standard를 준비합니다.

           표1. Diluted albumin(BSA) standard 준비

Standard Working Range = 100–1,500 μg/mL
VialVol. of DiluentVol. of Source of BSAFinal BSA Concentration
A0 μl300 μl of stock2,000 μg/ml
B125 μl375 μl of stock1,500 μg/ml
C325 μl325 μl of stock1,000 μg/ml
D175 μl175 μl of vial B dilution750 μg/ml
E325 μl325 μl of vial C dilution500 μg/ml
F325 μl325 μl of vial E dilution250 μg/ml
G325 μl325 μl of vial F dilution125 μg/ml
H400 μl100 μl of vial G dilution25 μg/ml
I400 μl0 μl0 μg/ml = Blank
Micro Working Range = 1-25 μg/mL
VialVol. of DiluentVol. of Source of BSAFinal BSA Concentration
A2,370 μl30 μl of stock25 μg/ml
B4,950 μl50 μl of stock20 μg/ml
C3,970 μl30 μl of stock15 μg/ml
D2,500 μl2,500 μl of vial B dilution10 μg/ml
E2,000 μl2,000 μl of vial D dilution5 μg/ml
F1,500 μl1,500 μl of vial E dilution2.5 μg/ml
G5,000 μl0 μl0 μg/ml = Blank


     B. Coomassie reagent의 혼합, 안정화

        사용 직전에  Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagent를 부드럽게 위 아래로 뒤집어서 흔들어 섞어줍니다.

        필요한 volume을 취하여 상온(RT)에서 안정화 시킵니다.


Test tube 사용 시,

   A. Standard test tube protocol (working range=100-1500μg/ml)

    1. 0.03ml (30μl)의 standard 또는 unknown sample을 라벨된 test tube에 분주합니다.

    2. 1.5ml의 Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagent를 각 tube에 첨가하고 잘 혼합 합니다.

    3. 선택사항: 일관성 있는 결과를 위해, 샘플을 상온(RT)에서 10분간 incubation 합니다.

    4. Spectrophotometer를 595nm로 설정하여, 물만 들어있는 cuvette 값을 0으로 셋팅한 후, 모든 sample의 흡광도를 측정합니다.

    5. Standard와 unknown sample의 측정값에서 blank 값을 뺍니다.

    6. Blank 값으로 교정된 농도별 BSA 값으로 표준곡선을 구합니다. 표준 곡선을 이용하여, unknown sample의 단백질 농도를 확인합니다.


   B. Micro Test Tube Protocol (working range=1-25μg/ml)

    1. 1ml의 standard 또는 unknown sample을 라벨된 test tube에 분주합니다.

    2. 1ml의 Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagent을 각 tube에 첨가하고 잘 혼합 합니다.

    3~6. 위의 protocol 내용과 동일


Microplate 사용 시,

   A. Standard microplate protocol (working range=100-1500μg/ml)

    1. 5μl의 standard 또는 unknown sample을 각 microplate well에 분주합니다.

    2. 250μl의 Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagent을 각 well에 첨가하고 30초동안 plate shaker에서 잘 혼합 합니다.

    3. Shaker에서 plate를 꺼내고, 일관성 있는 결과를 위해 샘플을 상온(RT)에서 10분간 incubation 합니다.

    4. Plate reader를 595nm로 설정하여 흡광도를 측정합니다.

    5. Standard와 unknown sample의 측정값에서 blank 값을 뺍니다.

    6. Blank 값으로 교정된 농도별 BSA 값으로 표준곡선을 구합니다. 표준 곡선을 이용하여, unknown sample의 단백질 농도를 확인합니다.


   B. Micro microplate Protocol (working range=1-25μg/ml)

    1. 150μl의 standard 또는 unknown sample을  각 microplate well에 분주합니다.

    2. 150μl의 Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagent을 각 well에 첨가하고 30초동안 plate shaker에서 잘 혼합 합니다.

    3~6. 위의 protocol 내용과 동일


Ordering information 


ProductSize
Cat No.

Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Kit, BSA 5X1mlKit 
P7200-050

Bradford(Coomassie) Protein Assay Plus Reagents450ml
P7201-050

Albumin Standard, 2mg/ml5X1ml
A1100-005

 



2. BCA(Bicinchonic Acid) method

: Lowry법을 개량한 방법으로, Folin시약 대신 Bicinchonate를 이용하여 산화된 copper 결합에 의해 보라색 발색 정도를 정량하는 방법

단백질이 구리 이온(Cu2+, Cu1+ )을 환원(reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용하여 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라색의 화합물을 생성하게 됩니다. 이 화합물은 특정 파장대(562 nm)에서 각각의 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액보다 빛의 흡수율이 높아, spectrophotometer로 흡광도 차이를 측정할 수 있습니다. 이 방법은 lowry method와 비교해서 방해물질, 특히 계면 활성제의 영향을 받지 않아 정확성이 높은 편입니다. 하지만 단점으로 단백질 변성이 생기고, 측정소요시간(60 min)이 다른 방법에 비해 오래 걸립니다.


Protocol  information

      A. Albumin(BSA) standard 희석 준비

           아래 표를 참고하여 protein standard를 준비합니다. 

           표2. Diluted albumin(BSA) standard 준비 

Standard Working Range = 20–2,000 μg/mL
VialVol. of DiluentVol. of Source of BSAFinal BSA Concentration
A0 μl300 μl of stock2,000 μg/ml
B125 μl375 μl of stock1,500 μg/ml
C325 μl325 μl of stock1,000 μg/ml
D175 μl175 μl of vial B dilution750 μg/ml
E325 μl325 μl of vial C dilution500 μg/ml
F325 μl325 μl of vial E dilution250 μg/ml
G325 μl325 μl of vial F dilution125 μg/ml
H400 μl100 μl of vial G dilution25 μg/ml
I400 μl0 μl0 μg/ml = Blank
Micro Working Range = 5-250 μg/mL
VialVol. of DiluentVol. of Source of BSAFinal BSA Concentration
A2,370 μl30 μl of stock25 μg/ml
B4,950 μl50 μl of stock20 μg/ml
C3,970 μl30 μl of stock15 μg/ml
D2,500 μl2,500 μl of vial B dilution10 μg/ml
E2,000 μl2,000 μl of vial D dilution5 μg/ml
F1,500 μl1,500 μl of vial E dilution2.5 μg/ml
G5,000 μl0 μl0 μg/ml = Blank


     B.  Bichinchninic Acid (BCA) Working Reagent (WR) 준비

         1. 다음 공식대로 필요한 working reagent 용량을 확인합니다.

              (#standards+#unknowns) x (#replicates) x (volume of WR per sample) = total volume WR required.

              예를 들어, Standard test tube protocol로 3개의 unknown sample을 2반복할 때 :

              (9 standards + 3 unknowns) x (2 replicates) x (2ml) = 48 ml WR가 필요합니다.

        2. BCA reagent A:B를  50:1비율로 혼합하여 WR를 준비합니다.


Test tube 사용 시 (Sample : WR 비율 = 1 : 20),

   1. 0.1ml (100μl)의 standard 또는 unknown sample을 라벨된 test tube에 분주합니다.

   2. 2ml의 WR을 각 tube에 분주하고 잘 혼합 합니다.

   3. 아래 온도와 시간을 선택하여 적용합니다.

      * Standard protocol: 37℃에서 30분 (working range= 20-2,000μg/ml)

      * RT protocol: RT에서 2시간 (working range= 20-2,000μg/ml)

      * Enhanced protocol: 60℃에서 30분 (working range= 5-250μg/ml)

   4. 모든 tube를 RT로 cooling 합니다.

   5. Spectrophotometer를 562nm로 설정하여, 물만 들어있는 cuvette의 값을 0으로 맞춘 후, 모든 sample의 흡광도를 10분 이내에 측정합니다.

   6. Standard와 unknown sample에서 blank의 값을 뺍니다.

   7.  Blank 값으로 교정된 농도별 BSA 값으로 표준곡선을 구합니다. 표준 곡선을 이용하여, unknown sample의 단백질 농도를 확인합니다.


Microplate 사용 시 (Sample : WR 비율 = 1 : 8),

   1. 25μl의 standard 또는 unknown sample을 microplate에 분주합니다. (working range=20-2,000μg/ml)

   2. 200μl의 WR을 각 well에 첨가하고 30초동안 plate shaker에서 잘 혼합 합니다.

   3. Plate 뚜껑을 덮고, 37℃에서 30분간 incubation 합니다.

   4. Plate를 RT에서 cooling 합니다.

   5.  562nm에서 흡광도를 측정합니다.

   6. Standard와 unknown sample에서 blank의 값을 뺍니다.

   7. Blank 값으로 교정된 농도별 BSA 값으로 표준곡선을 구합니다. 표준 곡선을 이용하여, unknown sample의 단백질 농도를 확인합니다.


Ordering information  


ProductSize
Cat No.

Bicinchoninic(BCA) Acid  Protein Assay Kit, BSA 5X1mlKit 
P8100-050

Bicinchoninic Acid  Protein Assay Reagent A450ml
P8101-050

Bicinchoninic Acid  Protein Assay Reagent B10ml
P8102-001

Albumin Standard, 2mg/ml5X1ml
A1100-005

 


[단백질 정량법 요약]


단백질 정량법Bradford methodBCA method

민감도High (-1 μg)High (-1 μg)

소요시간15 min60 min

흡광도(nm)595562

시약Coomassie brilliant blue G-250Cu2+ Bicinchoninic acid

장점* 발색반응 2분 내 완료
* 빠르고 간단
* 높은 감도 (1-20ug)
* 보편적으로 이용되는 방법
* 다른방법에 비하여 detergent 등에 의한 영향이 적음
* 아미노산 조성에 따른 발색

단점* Detergent, 강알칼리 등에 의해  방해 받음
* 단백질 마다 dye결합정도가 다름
* 석영 큐벳과 반응하기 때문에 유리/플라스틱 큐벳 사용
* 방법이 느리고, 단백질 변성이 있을 수 있음



* 제품 문의   T. 031-728-3237, E. technical@dawinbio.com 


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